Beta-Glucuronidasen sind Mitglieder der Glycosidase-Familie von Enzymen, die den Abbau komplexer Kohlenhydrate katalysieren. [2] Menschliche β-Glucuronidase ist eine Art von Glucuronidase (a Mitglied der Glycosidase-Familie 2), das die Hydrolyse von β-D-Glucuronsäureresten vom nicht reduzierenden Ende von Mucopolysacchariden (auch als Glycosaminoglykane bezeichnet) katalysiert, wie Heparansulfat. [2][3][4] Menschliche β-Glucuronidase befindet sich im Lysosom. [5] Im Darm wandelt die β-Glucuronidase mit Bürstenrand konjugiertes Bilirubin in die unkonjugierte Form für die Reabsorption um. Beta-Glucuronidase ist auch in der Muttermilch vorhanden, was zu Neugeborenen-Gelbsucht beiträgt. Das Protein wird durch das GUSB Gen kodiert. [6][7]
Structure [ edit ]
. Human-β-Glucuronidase wird als 80 kDa-Monomer (653 Aminosäuren) synthetisiert. Vor der Proteolyse werden 18 Aminosäuren vom C-terminalen Ende entfernt, um ein 78-kDa-Monomer zu bilden. [8][9]
Beta-Glucuronidase liegt als 332 kDa-Homotetramer vor. [10] Beta-Glucuronidase enthält mehrere bemerkenswerte strukturelle Formationen, einschließlich einer Art Beta-Fass bekannt als Jelly-Roll-Fass und TIM-Fass. [1]
Mechanismus der Katalyse [ edit ]
. Die humane β-Glucuronidase ist homolog zu dem Enzym ß von Escherichia coli -galactosidase. [11][12] Diese homologe Beziehung, zusammen mit der Erkenntnis, dass Glycosidasen häufig eine Hydrolyse durchführen, die von zwei sauren Resten katalysiert wird, ermöglichte die Entwicklung einer mechanistischen Hypothese. Diese Hypothese schlägt vor, dass die beiden Glutaminsäurereste Glu540 und Glu451 die nucleophilen und sauren Reste sind und dass der Tyrosinrest Tyr504 ebenfalls an der Katalyse beteiligt ist.
Zur Unterstützung dieser Hypothese führen experimentelle Mutationen in einem dieser drei Reste zu einer starken Abnahme der enzymatischen Aktivität. Erhöhte Aktivität eines E451A-Mutantenenzyms (wobei Glu451 durch einen Alaninrest ersetzt wird) nach Zugabe von Azid stimmt mit Glu451 als Säure / Base-Rest überein. [13] Verwendung der Analyse markierter β-Glucuronidase-Peptide nach Hydrolyse eines eingeführten Substrats In einem sehr stabilen Zwischenstadium haben die Forscher festgestellt, dass Glu540 der nucleophile Rest ist. [14]
Obwohl die von β-Glucuronidase verwendete Art der nucleophilen Substitution unklar ist, deuten Hinweise auf die Mechanismen ihrer Homologen in der Glycosidase-Familie auf diese Reaktionen hin qualitativ S N 2 Reaktionen. Die Reaktionen laufen durch einen Übergangszustand mit Oxocarbeniumionseigenschaften. Zunächst wurde angenommen, dass diese Mechanismen aufgrund dieses für den Übergangszustand charakteristischen Oxocarbeniums S N 1-Reaktionen sind, die durch ein diskretes Oxocarbeniumion-Intermediat laufen. Neuere Beweise legen jedoch nahe, dass diese Oxocarbenium-Ionenzustände Lebensdauern von 10 Femtosekunden bis 0,1 Nanosekunden aufweisen (ähnlich einer Bondvibrationsperiode). Diese Lebensdauern sind zu kurz, um sie einem Reaktionszwischenprodukt zuzuordnen. Aus diesen Beweisen geht hervor, dass diese Reaktionen, obwohl sie aufgrund der Oxocarbeniumionen-Charakteristika ihrer Übergangszustände ein S N 1 -Erlebnis aufweisen, qualitativ S N 2-Reaktionen sein müssen. [19659019DiespezifischeAktivitätvonTyr504imkatalytischenMechanismusistunklar[13] Durch Vergleich mit den Strukturdaten des homologen Enzyms Xylanase wurde vermutet, dass Tyr504 von β-Glucuronidase das austretende Nucleophil (Glu540) stabilisieren oder seine Aktivität modulieren könnte . [15]
Zusätzlich zu diesen Resten wurde vorgeschlagen, dass ein konservierter Asparaginrest (Asn450) das Substrat durch Einwirkung einer Wasserstoffbrücke an der 2-Hydroxylgruppe des Zuckersubstrats stabilisiert. [10][16]
Wiederholungseinheit des Heparans Sulfat-Substrat der β-Glucuronidase
Darstellung der Oberfläche der Tasche des aktiven Zentrums von β-Glucuronidase mit katalytischen Rückständen [1]
Mechanismus der β-Glucuronidase-Hydrolyse eines Zuckersubstrats mit hohen Energieübergangszuständen, die den Oxocarbeniumionencharakter zeigen [14]
Mögliche Stabilisierung des nucleophilen Rückstands Glu540 von Tyr504 in β-Glucuronidase [15]
Vorhergesagte Aktivität des konservierten Asn450-Rests bei der Stabilisierung des β-Glucuronidase-Zuckersubstrats [10][16]
Potentielle Salzbrücke zwischen Glu352 und Arg216 in humaner β-Glucuronidase edit ]
Mängel in der β-Glucuronidase führen zu einer autosomal-rezessiv vererbten Stoffwechselerkrankung, die als Sly-Syndrom oder Mucopolysaccharidosis VII bezeichnet wird. Ein Mangel an diesem Enzym führt zum Aufbau nicht hydrolysierter Mucopolysaccharide im Patienten. Diese Krankheit kann für den Patienten extrem schwächend sein oder vor der Geburt zu Hydrops fetalis führen. Darüber hinaus werden bei überlebenden Patienten mentale Retardierung, Kleinwuchs, grobe Gesichtszüge, Wirbelsäulenanomalien und Vergrößerung von Leber und Milz beobachtet. [5] Diese Krankheit wurde sowohl bei einem Mäusestamm als auch bei einer Hundefamilie modelliert. 19659032] Kürzlich haben Forscher eine Katzenfamilie entdeckt, die Mängel in der β-Glucuronidase-Aktivität aufweist. Die Ursache dieser Aktivitätsverringerung wurde als E351K-Mutation identifiziert (Glu351 ist zu einem Lysinrest mutiert). Glu351 ist in Säugetierspezies konserviert, was auf eine wichtige Funktion für diesen Rest hinweist. Die Untersuchung der Kristallstruktur des menschlichen Röntgenstrahls legt nahe, dass dieser Rest (Glu352 im menschlichen Enzym), der tief in der TIM-Barrel-Domäne vergraben ist, für die Stabilisierung der Tertiärstruktur des Enzyms wichtig sein kann. [17] In the Crystal Struktur, scheint es, dass Arg216, ein Mitglied der Jelly Roll-Domäne des Proteins, eine Salzbrücke mit Glu352 bildet; Glu352 ist daher wahrscheinlich an der Stabilisierung der Wechselwirkung zwischen zwei verschiedenen dreidimensionalen Domänen des Enzyms beteiligt. [1]
Molekulare Anwendungen: Verwendung als Reportergen edit
In der Molekularbiologie β-Glucuronidase wird als Reportergen verwendet, um die Genexpression in Säuger- und Pflanzenzellen zu überwachen. Die Überwachung der β-Glucuronidase-Aktivität durch Verwendung eines GUS-Assays ermöglicht die Bestimmung der räumlichen und zeitlichen Expression des betreffenden Gens. [20]
- Molekulare Grafikbilder wurden unter Verwendung des UCSF-Chimären-Pakets aus der Ressource für Biocomputing, Visualisierung und Informatik hergestellt die University of California, San Francisco (unterstützt von NIH P41 RR-01081). [21]
Siehe auch [ ]
. Referenzen [ .
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